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Acta Farm. Bonaerense 24 (4): 527-32 (2005)
Recibido el 11 de junio de 2005Aceptado el 19 de julio de 2005 Actividad Antiplasmódica In Vitro e Inhibición de la Formación de la β-Hematina de Plantas Colombianas de la Familia Annonaceae.
Edison OSORIO 1, Gabriel ARANGO 1*, Edison GARCÍA 1, Katalina MUÑOZ 1, Grace RUIZ 2, David GUTIÉRREZ 2, Marco Antonio PACO 2 & Alberto GIMÉNEZ 2 1 Grupo de Investigación en Sustancias Bioactivas (GISB). Sede de Investigación Universitaria SIU. Universidad de Antioquia. Calle 62 No. 52-59, Torre II, Lab 229. Medellín-Colombia. 2 Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés, Av. Saavedra 2224, La Paz-Bolivia. RESUMEN. Se evaluó la actividad antiplasmódica in vitro de 36 extractos provenientes de especies de la
familia Annonaceae sobre las cepas de Plasmodium falciparum
F32 sensible y W2 resistente a la cloroqui-
na. Igualmente fue evaluada la capacidad de inhibición de la formación de la
β-hematina (Ifβ-h) compa-
rando ambas actividades por medio de un estudio de correlación estadístico. Cuatro extractos presentaron
una potente actividad contra la cepa F32, y solamente tres mostraron actividad contra la cepa W2, siendo
el extracto de hexano de tallos de Rollinia exsucca
el mas activo en el estudio con una CI
de 3.0 y 4.8
µg/ml sobre las cepas F32 y W2, respectivamente. Solamente el extracto de acetato de etilo de hojas de
Desmopsis panamensis
mostró actividad Ifβ-h e inhibición del crecimiento de ambas cepas del parásito en
cultivo, mientras que el extracto de acetato de etilo de tallos de Rollinia pittieri
presento actividad Ifβ-h e
inhibición del crecimiento de la cepa F32. Fue observada una baja correlación entre ambas actividades.

SUMMARY. “In Vitro Antiplasmodial Activity and Inhibition of β-Hematin Formation of Colombian Plants of theFamily Annonaceae”. The antiplasmodial activity of 36 plant extracts related to the Annonaceae family was test-ed on chloroquine sensitive strain F32 and chloroquine resistant strain W2 of Plasmodium falciparum. The capaci-ty of inhibition of β-hematin formation (Ifβ-h) was also evaluated comparing both activities by means of a statisti-cal correlation study. Four extracts presented a potent activity against F32 and three only showed activity againstW2, being the hexane stem bark extract of Rollinia exsucca the most active with CI50 values of 3.0 and 4.8 µg/mlagainst F32 and W2, respectively. Only the ethyl acetate leaves extract of Desmopsis panamensis showed Ifß-hactivity and growth inhibition of both strain, while the ethyl acetate stem bark extract of Rollinia pittieri presentsIfβ-h activity and growth inhibition of F32. A low correlation was observed among both activities.
INTRODUCCIÓN
partir de especies del género Cinchona (Rubia- La malaria es una enfermedad producida por ceae) nativo de Sudamérica y otros derivados parásitos del género Plasmodium. Según cálcu- sintéticos desarrollados posteriormente que han los de la Organización Mundial de la Salud mostrado ser más efectivos, menos tóxicos y de (OMS), anualmente ocurren entre 300 a 500 mi- bajo costo 2. El desarrollo de resistencia de P. llones de casos clínicos de la enfermedad, de falciparum a los medicamentos disponibles for- los cuales 1,5 a 2,7 millones son mortales, ade- zó la investigación de nuevos compuestos con más 2.400 millones de personas viven en regio- actividad antiplasmódica y permitió el descubri- nes de alto riesgo para su transmisión, lo que miento de la mefloquina y la cloroquina, esta hace de esta enfermedad la principal causa de última aún se utiliza en algunas regiones de morbilidad y mortalidad en 90 países ubicados África y Sudamérica. El descubrimiento reciente en las regiones tropicales y subtropicales del más importante es la artemisinina, una sesqui- mundo, especialmente en la región al sur del terpenlactona con un puente endoperóxido ob- Sahara en África, el sudeste de Asia y Latinoa- tenida de Artemisia annua (Asteraceae) y el de- sarrollo de sus derivados, el artemether y el ar- El tratamiento de la malaria se ha realizado tesunato, los cuales son medicamentos de rápi- con diversos medicamentos que actúan sobre da acción y efectivos contra cepas de P. falcipa- estadios eritrocíticos del parásito, entre los que rum resistentes a múltiples medicamentos 3. Sin se encuentran la quinina, un alcaloide aislado a embargo, la actividad de la artemisinina y sus PALABRAS CLAVE: Actividad antiplasmódica, Annonaceae, β-hematina.
KEY WORDS: Annonaceae, Antiplasmodial activity, β-hematin.
Autor a quien se debe de dirigir la correspondencia: E-mail: gjarango@quimbaya.udea.edu.co. OSORIO E., ARANGO G., GARCÍA E., MUÑOZ K., RUIZ G., GUTIÉRREZ D., PACO M.A., GIMÉNEZ A.
derivados se ve afectada por su baja solubilidad partir de plantas colombianas, fueron evaluados y pobre biodisponibilidad. Además, aunque los 36 extractos provenientes de 6 especies de la fa- derivados presentan una mejor absorción, rápi- milia Annonaceae contra parásitos de P. falcipa- da acción y mayor efectividad contra P. falcipa- rum resistentes y sensibles a cloroquina, igual- rum multirresistente, presentan citotóxicidad y mente, se evaluó la capacidad de inhibición de la formación de la β-hematina, sustancia sintéti- No obstante, el tratamiento de la malaria ca idéntica a la hemozoina (pigmento malárico).
continúa como uno de los mayores retos para Una de las hipótesis mayormente aceptada es los programas de control, debido al fenómeno que la cloroquina y otros antimaláricos quinolí- de resistencia del parásito contra los medica- nicos actúan inhibiendo la formación de la he- mentos. Esta resistencia se debe a la capacidad mozoina, por lo tanto este proceso permanece del parásito para mutar genes específicos 6, a la como un blanco atractivo para la búsqueda de alta frecuencia de recombinación génica que da nuevos compuestos antimaláricos 22. Se muestra origen a poblaciones de parásitos con nuevos estadísticamente la correlación entre ambas acti- determinantes antigénicos y con modificaciones en los sitios blanco para la acción de medica-mentos 7, a los sistemas de transporte activo es- MATERIALES Y MÉTODOS
pecíficos para compuestos antimaláricos y a las Procedimientos experimentales generales
prácticas clínicas inadecuadas como el uso de El ensayo de inhibición de la formación de antimaláricos profilácticos, tratamientos incon- la β-hematina fue desarrollado por espectrofoto- clusos o con dosis sub-terapéuticas 8. La meflo- metría ultravioleta-visible utilizando un equipo quina se utilizó por más de 10 años, pero se re- Spectronic® Genesys 2 y una centrífuga 5415 gistró resistencia en el sudeste de Asia con resis- Eppendorf, Brinkmann. Los espectros IR se rea- tencia cruzada a quinina y con efectos tóxicos lizaron en un equipo Perkin-Elmer (FT-IR) utili- considerables. Igualmente durante muchos años zando un rango de barrido entre 4000 y 600 la cloroquina fue el tratamiento de elección para cm–1. El pH se determino con un pHmetro mar- la malaria, pero en 1957 se reportaron los pri- meros casos de resistencia en Sudamérica y des-de entonces el fenómeno se expandió a toda Químicos
América, África y Asia. En algunas regiones se Los solventes utilizados para la elaboración ha informado de resistencia a todos los antima- de los extractos son de grado reactivo suministra- láricos disponibles con excepción de los deriva- dos por J.T. Baker. La hemina (C34H32ClFeN4O4) dos de la artemisinina, los cuales aún se reser- y el medicamento control difosfato de cloroquina van para los casos de malaria que no responden (CQ) fueron adquiridos en Sigma Chemical Co, a los demás medicamentos 8. Esta resistencia a St Louis, Mo. Los reactivos hidróxido de sodio, los medicamentos actualmente disponibles ha ácido acético, acetato de sodio trihidratado, di- llevado a la necesidad de desarrollar nuevos metilsulfóxido (DMSO) fueron obtenidos de Sig- compuestos antimaláricos que permitan mejorar El estudio sobre la medicina tradicional co- Material vegetal y preparación de
mo fuente que conduce al descubrimiento de extractos
nuevos agentes antiparasitarios, ha encontrado Las especies de la familia Annonaceae Anno- que plantas de la familia Annonaceae han sido na muricata, Desmopsis panamensis, Pseudo- utilizadas por comunidades colombianas como malmea boyacana, Rollinia exsucca, Rollinia antiparasitarias 9,10. Algunas especies de esta pittieri y Xylopia aromática fueron recolectadas gran familia, la cual comprende alrededor de en el corregimiento de Lomas Aisladas del Mu- 120 géneros y más de 2000 especies, presentan nicipio de Turbo (Antioquia, Colombia) por el interesantes metabolitos con actividad biológica: biólogo Fernando Alzate e identificado en el polifenoles, aceites esenciales, terpenos, com- Herbario de La Universidad de Antioquia (Vou- puestos aromáticos 11, siendo particularmente chers en Tabla 1). El material vegetal (tallos y activos las acetogeninas 12, moléculas con am- hojas) fue secado a 40 °C en estufa con circula- plio espectro de acción anticancerígena 13, anti- ción de aire, pulverizado y extraído exhaustiva- parasitaria 14,15 e insecticida 16 y los alcaloides mente por percolación con solventes orgánicos de tipo bisbencilisoquinoleicos 17,18, protoberbe- de diferente polaridad (hexano, acetato de etilo rinas, oxoaporfínicos 19,20 y aporfínicos 21. En la y metanol) hasta agotar el material, el solvente investigación de nuevos agentes antimaláricos a fue removido bajo presión reducida. Para el en- acta farmacéutica bonaerense - vol. 24 n° 4 - año 2005 sayo de inhibición de la formación de la β-he- medio RPMI 1640 suplementada con suero al matina, los extractos en metanol fueron disueltos 10% y un hematocrito del 4% (Grupo sanguíneo en una solución agua-etanol (30:70) y los de ex- 0, Rh+) a 37 °C en un medio anaeróbico. Los tractos en hexano y acetato de etilo en DMSO.
extractos fueron disueltos en DMSO y la cloro-quina en agua para luego ser diluidos con el Actividad antiplasmódica in vitro
mismo medio obteniéndose las concentraciones La actividad antiplasmódica se realizó por el requeridas (0.10 ; 1.0 y 10.0 µg/ml). Los cultivos método de cultivo continuo in vitro desarrollado fueron sincronizados con una parasitemia y un en 1976 por Trager & Jensen 23. De acuerdo con hematocrito del 1 y 2% respectivamente, estos esta técnica las formas parasitarias de P. falcipa- fueron alicuotados en un volumen de 100 µl en rum cepa F32 sensible a la cloroquina y W2 re- placas de 96 pozos por duplicado, además de sistente a la cloroquina, fueron cultivadas en 100 µl de los extractos, y finalmente fueron in- P. falciparum a
Solvente
Ifβ-h (%) d
científico
F32 b
W2 c
Tabla 1. Actividad antiplasmódica in vitro sobre P. falciparum (IC50) y porcentaje de inhibición de la formación
de β-hematina (promedio ± SD) de extractos de especies de la familia Annonaceae. a Actividad antiplasmódica,
% de Inhibición a 10 µg/ml (CI50, µg/ml ). b F32, cepa de P. falciparum sensible a CQ. c W2, cepa de P. falci-
parum
resistente a CQ. d Ifβ-h, porcentaje de inhibición de la formación de β-hematina.
OSORIO E., ARANGO G., GARCÍA E., MUÑOZ K., RUIZ G., GUTIÉRREZ D., PACO M.A., GIMÉNEZ A.
cubados a 37 °C por 48 horas. Pasado este tiem- (CQ) fue utilizado como control positivo y su po de incubación, se eliminó completamente la actividad inhibitoria es expresada en términos fase superior del cultivo, para realizar un frotis de CI50, es decir la concentración de CQ nece- del sedimento de cada alveolo, fijando luego saria para la inhibición del 50% de la formación con metanol y realizando la tinción con Giemsa, de β-hematina, y es calculada mediante el pa- estas placas fueron observadas en el microsco- quete estadístico GraphPad Prism® demo, Ver- pio, con lente de inmersión 100x, contando gló- sión 4.00 para Windows, (GraphPad software, bulos rojo no infectados (GRL) y glóbulos rojos Inc, San Diego CA 2003). Los ensayos fueron re- infectados (GRI), para obtener el % de Inhibi- ción calculado mediante la fórmula [1]: RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en el estudio de ac- tividad antiplasmódica in vitro de extractos deespecies de la familia Annonaceae son mostrados El cálculo para hallar la Concentración Inhi- en la Tabla 1. Los extractos fueron evaluados a bitoria del 50% en la maduración de los esqui- una concentración de 10 µg/ml y aquellos que zontes (CI50), se realizó por un método gráfico presentaron una inhibición mayor del 50% en el mediante el programa Cricket Graph 1.3, consi- crecimiento de las cepas de P. falciparum sensi- derándose como activos aquellos que presenta- ble (F32) y resistente (W2) a CQ, se les calculó la CI50 y fueron considerados como extractos depotente actividad antiplasmódica. Los extractos Inhibición de la formación de la β-hematina
de hojas (EtOAc) de D. panamensis, tallos (EtO- Para el ensayo de inhibición de la formación Ac) de P. boyacana, tallos (Hexano) de R. exsuc- de la β-hematina se utilizó el método de Bael- ca y tallos (EtOAc) de R. pittieri, mostraron acti- mans et. al. 24 con algunas modificaciones. En vidad contra la cepa F32, y solamente los extrac- resumen, la síntesis de la β-hematina fue realiza- tos de hojas (Hexano y EtOAc) de D. panamen- da con una mezcla de 100 µl de hemina 6,5 mM sis y tallos (Hexano) de R. exsucca mostraron ac- recién preparada disuelta en una solución de tividad en la cepa W2. Este último extracto resul- NaOH 0,2 N, 50 µl de ácido acético glacial 17,4 tó ser el más activo en el estudio de actividad an- M, 50 µl de H2O destilada y 200 µl de tampón tiplasmódica con una CI50 de 3,0 y 4,8 µg/ml en acetato de sodio trihidratado 3 M, pH final apro- las cepas F32 y W2 de P. falciparum respectiva- ximadamente 4,0, fue incuba por 1,h a 60 °C.
mente. La CI50 de la CQ usada como medica- Posteriormente fue centrifugada a 12000 rpm mento control en el ensayo fue de 30 nM contra durante 10 min, luego de descartar el sobrena- la cepa F32 y 51 nM contra la cepa W2.
dante, el precipitado es lavado 3 veces con 200 Igualmente se evaluó la actividad de inhibi- µl de DMSO para remover la hemina no reac- ción de la formación de la β-hematina (Ifβ-h) a cionante. El sólido β-hematina obtenido fue di- los diferentes extractos (Tabla 1). La relevancia suelto en una solución de NaOH 0,1 N de la de evaluar dicha actividad se basa en la siguien- cual se toma una alícuota para la lectura espec- te observación: Durante su ciclo intraeritrocítico, trofotométrica a 386 nm y corresponde al 100% el parásito de la malaria degrada una gran canti- de β-hematina sintetizada. La formación de β- dad de hemoglobina presente en el citoplasma hematina se monitoreo por espectroscopía IR- de la célula hospedera (entre el 60-80%) 25. Du- TF. Para la evaluación de la actividad inhibitoria rante el proceso de proteolisis de hemoglobina de los extractos, los 50 µl de H2O fueron rem- en su vacuola digestiva ácida es producido he- plazados por una solución del extracto corres- me (Ferriprotoporfirina IX), un compuesto po- pondiente a una concentración final de 2,5 tencialmente tóxico para el parásito. El parásito mg/ml y con la lectura espectrofotométrica fue carece de heme oxigenasa, enzima que dispone calculado el porcentaje de inhibición mediante del compuesto en otras especies, entonces lo detoxifica en parte por su incorporación en unasustancia cristalina, inerte e insoluble denomina- da hemozoina (o pigmento malárico) 26,27 y el resto por procesos de degradación peroxidati- vos. Esta función especializada hace de la va- Donde Abmuestra y Abcontrol son la absorban- cuola digestiva un blanco atractivo para la bús- cia de la β-hematina con y sin el uso de extrac- queda de nuevos compuestos antimaláricos, un tos, respectivamente. El difosfato de cloroquina compuesto capaz de inhibir la formación de he- acta farmacéutica bonaerense - vol. 24 n° 4 - año 2005 mozoina, podría ser potencialmente letal para el dows 4.1 (Statistical Graphics Corp, 1999) (Fig.
parásito. Para muchas sustancias, su habilidad 1). No hay una significante correlación entre las de inhibir esta formación esta directamente rela- actividades antiplasmódica sobre la cepa F32 y cionada con su potencia antimalárica 28,29.
W2 con la Ifβ-h con un índice de correlación de Una sustancia similar a la hemozoina, la β- hematina, puede ser formada in vitro a partir de La falta de correlación puede deberse a fac- una solución de hemina (hidroxi-ferriprotoporfi- tores relacionados con la incapacidad de los rina IX) bajo ciertas condiciones de pH, tempe- principios activos de los extractos de alcanzar el ratura y concentración de sales que simulan el sitio de formación de la hemozoína y de poder ambiente de la vacuola digestiva 30. La β-hemati- acumularse en la vacuola digestiva ácida del pa- na sintética es espectrofotométrica y química- rásito a concentraciones efectivas. Las moléculas mente idéntica a la hemozoina, además conser- deben de penetrar libremente a través de un va las propiedades de solubilidad de la sustan- complejo sistema de membranas: por parte del cia nativa 31, siendo útil en el estudio y diseño eritrocito, la membrana celular y la membrana de nuevos agentes terapéuticos. La metodología de la vacuola parasitófora y, por parte del pará- aplicada para la formación de β-hematina se sito, su membrana y la membrana de la vacuola monitoreó por espectroscopía de IR-TF, en don- digestiva 24. Así mismo, se ha demostrado la im- de se distingue inequívocamente hemina de β- portancia que tiene la acumulación de la droga hematina 32. El espectro IR de β-hematina mos- a nivel de la vacuola digestiva ácida del parási- tró bandas a 1662 y 1209 cm–1 características de to, en cuanto a la potencia de compuestos anti- la unión hierro-carboxilato 27, las cuales no es- maláricos y el efecto que ejerce esta acumula- tán presentes en el espectro IR de la hemina ción sobre la actividad de inhibición de la for- mación de la hemozoína 33. Factores como el Entre los 36 extractos examinados por su ac- pH ácido de la vacuola digestiva y los sitios dis- tividad Ifβ-h (Tabla 1), hojas (EtOAc) de A. mu- ponibles en donde la droga tenga la posibilidad ricata, hojas (EtOAc) de D. panamensis, hojas de unirse al heme, pueden afectar dicha acumu- (Hexano) de R. exsucca, hojas (Hexano) y tallos lación. Por supuesto, otra posible alternativa (EtOAc) de R. pittieri presentaron porcentajes de puede deberse a la posibilidad de que los com- inhibición mayores del 85% cuando fueron eva- puestos activos no interfieran con la formación luados a una concentración de 2,5 mg/ml. La de la hemozoina y su mecanismo de acción sea CI50 de la CQ fue de 1,15 mg/ml (2,24 mM) yestuvo en concordancia con previos reportes endonde se muestra que un exceso molar de CQsobre la hemina previene la formación de la β-hematina 24. Bajo las condiciones de la presenteinvestigación, (pH 4,0, 60 °C), 1,80 mg/ml (3,5mM) de CQ inhibió el 96% la formación de la β-hematina. Solamente el extracto de las hojas deD. panamensis mostró actividad Ifβ-h e inhibi-ción del crecimiento de ambas cepas del parási-to en cultivo, mientras que el extracto de tallosde R. pittieri presentó actividad Ifβ-h e inhibi-ción del crecimiento de la cepa F32 sensible aCQ. Para estos 2 últimos extractos, la correla-ción entre la actividad Ifβ-h y la actividad anti-plasmódica es clara, sin embargo, para los de-más extractos considerados como extractos depotente actividad antiplasmódica, la correlacióncon la actividad Ifβ-h no fue evidente. Estos ex-tractos mostraron porcentajes de inhibición me-nores del 65%, e inclusive extractos como el de Figura 1. Correlación de la actividad antiplasmódica y
tallos de R. exsucca presentó una actividad Ifβ-h la actividad de inhibición de la formación de β-hemati- cercana a 23%. Para estudiar la relación entre na. (A) Actividad antiplasmódica calculada sobre la ce-
estas dos actividades, se realizó un análisis de pa F32, índice de correlación de 0.09, p-value = 0.60.
correlación mediante el método de Pearson uti- (B) Actividad antiplasmódica calculada sobre la cepa
lizando el programa Statgraphics Plus para Win- W2, índice de correlación de 0.11, p-value = 0.51.
OSORIO E., ARANGO G., GARCÍA E., MUÑOZ K., RUIZ G., GUTIÉRREZ D., PACO M.A., GIMÉNEZ A.
totalmente diferente. Al menos esto podría ser tein & R. Antón (2001) J. Ethnopharmacol. 78:
el caso de extractos como el de tallos de R. ex- succa y hojas de Desmopsis panamensis, los 11. Leboeuf, M., A. Cave, P. Bhaumik, B. Mukher- cuales mostraron potente actividad antiplasmó- jee & R. Mukherjee (1982) Phytochemistry 21:
12. Cave, A., B. Figadere, A. Laurens & D. Cortes CONCLUSIONES
(1997) “Acetogeninas from Annonaceae” (W.
Herz, G.W. Kirbi, R.E. Moore & W. Steglich, En anteriores reportes se había estudiado ya la pertinencia de la inhibición de la formación 13. Oberlies, N.H., V.L., Croy, M.L., Jarrison, & J.L.
de β-hematina en relación a la detección de po- McLaughlin (1997) Cancer Lett. 115: 73-9.
tenciales compuestos antimaláricos a partir de 14. Jaramillo, M.C., G.J. Arango, M.C. González, extractos 24; sin embargo, se plantea ahora un S.M. Robledo, I.D. Vélez (2000) Fitoterapia 71:
análisis estadístico que muestra una significativa no correlación entre la actividad antiplasmódica 15. Février, A., M.E. Ferreira, A. Fournet, G. Yaluff, in vitro y la inhibición de la formación de β-he- A. Inchausti, A. Rojas de Arias, R. Hocquemiller matina. A pesar de este resultado, la informa- & A.I. Waechter (1999) Planta Med. 65: 47-9.
ción suministrada por el ensayo de actividad 16. Ahammadsahib, K.I., R.M. Hollingworth, J.P.
Ifβ-h es importante en la búsqueda de alternati- McGovren, Y.H. Hui & J.L. McLaghlin (1993)
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vas terapéuticas contra la enfermedad de la ma- 17. Mambu, L., M.T. Martín, D. Razafimahefa, D.
laria, toda vez que exista la posibilidad de en- Ramanitrashasimbola, P. Rasoanaivo & F. Frap- contrar compuestos que interfieran con la for- pier (2000) Planta Med. 66: 537-40.
mación de la hemozoina y que además, reúnan 18. Mahiou, V., F. Roblot, A. Fournet, & R. Hoc- las características fisicoquímicas necesarias para quemiller (2000) Phytochemistry 5 4: 709-16.
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Agradecimientos. Este trabajo fue financiado por
Croft & J.D. Phillipson (2000) Planta Med. 66:
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